전기영동

목차

A. 배양세포로부터 단백질의 분리

B. 단백질의 정량

C. 단백질의 전기영동(SDS-PAGE)

본문내용

어주면서 gel을 조심스럽게 관찰한다.
* 수분내에 염색된 단백질 띠가 나타나야 하며 원하는 대조가 얻어질 때까지 염색을 한다.
* Formaldehyde의 증기는 독성이 있으므로 이를 포함하는 용액은 hood에서 만들어야 한다.
* 염색 시간이 길면 gel 자체가 염색되며 배경이 좋지 않다.
9. 수분동안 1% acetic acid를 가하여 반응을 끝내고 gel을 증류수에 10분씩 여러차례 세척한다. 때때로 반짝이는 회색의 은막이 gel 표면에 형성되며 이것은 4배 희석된 사진 현상용액에 2∼3초 세척함으로써 쉽게 제거될 수 있다.
10. Gel을 말려 보관한다.
* 참고사항
사진 현상 용액은 다음과 같이 제조한다.
1) 용액 A: NaCl 37 g과 CuSO4 37 g을 850 ml 증류수에 녹인다. 짙은 푸른 침전이 생긴 후 다시 녹을 때까지 농축 암모니아를 가한 후 부피를 1 liter로 희석한다.
2) 용액 B: Sodium thiosulfate 436 g을 증류수에 녹여 1 liter로 만든다.
3) 같은 부피의 용액 A와 B를 혼합한 후 혼합용액의 3배 부피 증류수에 희석한 다음 즉시 사용한다.
4) SDS-polyacrylamide gel 말리기
[35S]로 표시된 단백질을 포함하고 있는 SDS-polyacrlamide gel은 자가방사법에 의한 사진을 얻기 위해 반드시 먼저 말려야 한다. Gel을 말리는 과정에서의 어려운 점 두가지는 gel이 쪼그라들면서 변형되는 것과 금이 가는 것이다. Gel을 말리기 전에 Whatman 3MM 종이에 부착시킴으로써 gel이 쪼그라드는 것을 방지할 수 있으나 금이 가는 것을 방지할 수는 없다. Gel이 polyacrylamide를 많이 함유하고 두꺼울수록 갈라짐이 심해지므로 진공 압력의 변화가 적은 좋은 품질의 gel 건조기를 사용하여야 하며 가능한한 얇은 gel을 사용하도록 한다. Gel이 갈라지는 것은 gel 건조기에서 수분이 완전히 제거되기 전에 gel을 건조기에서 꺼내는 경우 잘 일어나므로 주의를 요한다.
1. Gel을 전기영동 기구에서 떼어낸 후 실온에서 5∼10배 부피의 10% acetic acid, 30% methanol 혼합용액에 고정시킨다.
* Bromophenol blue는 산성 고정 용액에서 노란색으로 변하여 gel에 퍼지게 된다. 처음색이 완전히 사라진 후 5분 정도 고정액에 놓아둔 후 gel을 증류수에 세척한다.
2. Gel보다 약간 더 큰 비닐 랩 위에 gel을 놓고 오른쪽 아래 모서리에 표시를 한다.
3. 습기가 있는 gel 위에 Whatman 3MM 종이를 놓는다. 종이는 gel의 가장자리보다는 약간 더(1∼2 cm) 크고 gel 건조기보다는 작게 준비를 한다.
* Gel에 한번 붙은 3MM 종이를 다시 움직이게 하면 안된다.
4. 다른 3MM 종이를 gel 건조기의 표면에 올려놓는다. 이때 종이는 gel 전체를 올려놓기에 충분하게 준비를 한다.
5. 2∼3 번에서 준비한 3MM 종이/gel/비닐랩을 포개어 건조기의 3MM 종이 위에 놓는다. 이때 비닐랩이 제일 위에 위치하도록 한다.
6. 건조기의 덮개를 덮어 진공이 완전히 걸리게 한다. 건조기에 전열기가 달려있는 경우 gel을 빨리 말리기 위하여 50∼80°C로 가열한다.
7. 건조기의 제작사에서 권장하는 시간동안 gel을 말리며(보통 0.75 mm 경우 2시간) 가열하면서 말릴 경우에는 진공을 풀기 수분전에 가열을 중지하여야 한다.
8. 3MM 종이에 달라붙은 gel을 건조기로부터 분리해 낸다.
9. 비닐랩을 제거한 후 자가방사하기 위해 암실에서 필름에 감광시키거나 실험자료로 보관한다

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전기영동,   전기영동실험,   단백질 분리