단백질의 분리와 정제법

소개글

단백질의 분리와 정제법에 대한 보고서 자료입니다.

목차

서 론

본 론
1. 단백질 정제의 목적과 고려 사항
2. 단백질 용해 과정
3. 단백질의 안정화
4. 단백질의 분리 정제 및 농축
5. 정제된 단백질의 순도 검정
6. 정제된 단백질의 변형 및 오염물질에 대한 처리
7. 참고문헌.......식물생리학 실험,

본문내용

pH에서는 음전하를 띠게 되어 양극으로 이동한다. 전기영동은 하전된 분자를 지지체를 사용하지 않고 용액상태에서 분리하는 계면이동(moving boundary) 전기영동과 불용성인 지지체를 사용하는 띠(zone) 전기영동이 있는데 현재 전자는 거의 이용되지 않고 후자의 polyacrylamide 겔 전기영동등이 많이 이용된다.
Polyacrylamide겔과 같은 지지체에 분리하고자 하는 단백질 시료를 가하고 전류를 흐르게 하면 각 단백질 띠(zone) 모양으로 분리되기 때문에 띠 전기영동이라 하는데 이 방법은 해상력이 좋고 미량 분석이 가능하다. Polyacrylamide 겔은 acrylamide나 methylenebisacrylamide의 농도를 조절하여 pore의 크기를 임의로 결정할 수 있기 때문에 분자체로서의 작용도 겸할 수 있어 지지체로 가장 많이 사용된다.
(1) SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)
이 방법은 단백질을 분자량에 따라 분리하는 방법으로 단백질을 SDS로 처리하면 비공유결합이 전부 파괴되어 변성될 뿐만 아니라 소합체성 단백질인 경우에는 각각의 단위체로 분리되기 때문에 SDS-polyacrylamide 겔 전기영동은 단백질의 분자량 뿐만 아니라 단위체의 유무를 결정하는 데 매우 유용하다. 단위체가 disufide 결합으로 연결되어 있는 경우에는 전기 영동을 시행하기 전에 mercaptoethanol등으로 처리하여 disulfide 결합을 끊어 주어야 한다. SDS가 단백질과 결합하여 SDS-단백질 복합체를 형성하면 SDS의 sulfate기 때문에 단백질 자체의 전하는 거의 무시되고 강한 음전하를 띠게 된다. 대부분의 단백질은 SDS와 거의 일정 비율(단백질 1g 당 SDS 1.4g)로 결합하므로 단백질의 질량에 대한 전하비가 일정하여 전장에서의 이동속도는 단백질 분자의 크기에 좌우된다. 단백질이 이동한 거리는 단백질 분자량의 대수와 역 상관 관계에 있으므로 이동거리로부터 분자량을 알아낼 수 있다(그림 참조).
(2) Isoelectric focusing
이 기법은 단백질을 등전점(pI)의 차이에 따라 분리하는 방법으로 지금까지 개발된 전기영동법 중에서 해상력이 가장 뛰어나 단백질 시료를 정밀하게 분석하는 데 많이 사용된다. 이 방법은 단백질이 이동해 갈 때 겔의 음극쪽으로 갈수록 pH가 증가하도록 pH 차이(pH gradient)를 만들어 단백질들이 각자의 등전점과 다른 pH 겔 상에 있을 때는 전하를 띠게 되므로 양 또는 음극으로 이동하다가 각자의 등전점의 위치에 이르게 되면 전하를 띠지 않게 되므로 그 자리에 멈추게 되어 단백질마다 하나의 띠를 형성하는 focusing 현상이 일어난다.
이론적으로 pH 차이는 양극쪽에 산을 가하고 전류를 통하면 H+이 음극쪽으로 이동해 가므로 pH 차이가 형성되나 이때 형성된 pH 차이는 불안정하여 단백질 분리에 사용할 수 없기 때문에 pH 차이를 안정화시키기 위하여 ampholyte를 겔에 첨가한다. Ampholyte 시약에는 등전점이 서로 다른 여러 종류의 물질들이 섞여 있기 때문에 전장에서 이들은 등전점의 차이에 따라 낮은 등전점을 갖는 것은 양극쪽으로, 높은 등전점을 갖는 것은 음극쪽으로 배열하여 안정된 pH 경사를 형성한다.
SDS-PAGE와 isoelectric focusing을 연결하여 아래 그림 b에서 와 같이 two-dimensional gel electrophoresis를 시행 할 수 있다.
5. 정제된 단백질의 순도 검정
정제한 단백질의 순도를 확인 하는 일은 여러 가지 방법을 사용할 수 있다. 이곳에서는 다음의 5가지로 요약하고자 한다.
1) 고정된 특이활성을 가지는 경우를 확인 할 수 있다. 특이 활성이라 함은 단백질 단위 mg당 그 단백질의 생물학적 활성을 나타내는 것으로 여러 단백질들과 혼합되어 있다면 특이활성값은 매우 낮을 것이고, 순도가 높은 것일수록 특이활성이 높다고 할 수 있다.
2) 단백질을 전기영동하였을 때 하나의 띠를 형성하면 순도가 높다고 확인할 수 있다. 또한 SDS-PAGE를 하였을 때 확인된 분자량과 동일 한지를 확인하여 순도등을 확인할 수 있다.
3) 전기영동과 비슷한 방법인 isoelectric focusing을 실시하여 하나의 띠를 확인함으로 순도를 검정할 수 있다.
4) 만일 정제하고자 하는 단백질에 대한 항체가 있다면 항체를 이용하여 정제한 단백질과의 반응성으로 확인 할 수 있다.
5) 마지막으로 확인 할 수 있는 것은 정제한 단백질의 아미노 말단이나 카복시말단의 아미노산 조성을 분석하여 동일한지를 확인하여 단백질의 순도를 검정할 수 있다.
6. 정제된 단백질의 변형 및 오염물질에 대한 처리
단백질이 아무리 고순도로 정제되었더라도 여러 가지 문제를 내포할 수 있다. 그 중 가장 커다란 문제점은 단백질의 변형과 불순물의 오염을 예로 들 수 있는데 오염의 형태는
1) aggregation
2) oxidation of methionine residues
3) Deamination of asparagine/glutamine residues
4) Incorrect disulphide bond formation
5) Proteolysis by endo- or exo-acting proteases
6) Enzymatic alteration of post-translational modification
(glycosylation)
이러한 경우 정제된 단백질의 활성이 비특이적이며, 비정상적이기 때문에 단백질의 변형을 방지하기 위하여 단백질의 정제과정에서 각 과정마다 활성을 검증하는 과정을 거치는 것이 좋다.
※목차
서 론
본 론
1. 단백질 정제의 목적과 고려 사항
2. 단백질 용해 과정
3. 단백질의 안정화
4. 단백질의 분리 정제 및 농축
5. 정제된 단백질의 순도 검정
6. 정제된 단백질의 변형 및 오염물질에 대한 처리
7. 참고문헌.......식물생리학 실험, bioaio.com.ne.kr, deakil.cafe24.com, medicine.chungwk.ac.kr...

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단백질의 분리,   정제법,   단백질,   식품영양,   영양과학