생리 활성물질의 분리정제 방법과 분리정제의 실험 예

목차

1. 서 론

2. 활성물질의 초기탐색 단계에서의 분리 정제
2.1 활성물질의 분리와 동정시 고려할 사항들
2.2 탐색 초기단계에서의 물질의 양적 개념
2.3 예비 추출 실험방법
2.4 탐색 초기단계에서의 TLC 방법의 유용성
2.5 TLC의 실제 이용방법

3. 분리정제 방법과 그 조작법
3.1 지용성물질의 추출 정제방법
3.1.1 배양액으로 부터 지용성물질의 추출법
3.1.2 조추출물 (crude extracts)로 부터 지용성물질의 분리정제
3.2 수용성물질의 분리 정제 방법

4. 분리정제의 실험예
4.1 Promothiocin A와 B 및 thiotipin의 정제과정
4.2 Phosmidosine의 분리정제 과정
4.3 11-Hydroxy aclacinomycin A(1), -B(2), -X(3), -T(4)의 분리정제 과정
4.4 Okadaic acid의 분리정제 과정
4.5 Altemicidin의 분리정제 과정

본문내용

mg), 3 (7 mg), 4 (56 mg)을 순수 분리하였다.
4.4 Okadaic acid의 분리정제 과정
이 물질은 해양생물로부터 분리된 약리활성이 강하고 구조적으로 특이한 polyether계 물질로서, P388, L1210, KB 세포주에 강한 세포독성과 평활근의 독특한 수축작용을 나타내고 있으며 최근에는 protein serine/threonine phosphatase의 저해제로 알려져 있다. 정제과정을 살펴보면 다음과 같다.
3.6 kg의 Halichondria melanodocia를 isopropyl alcohol (15 liter)로 추출하고 rotary evaporator로 대부분의 alcohol을 제거하고 계속해서 dichlomethane (CH2Cl2)으로 추출 농축했다. 이것을 500 ml의 methanol-물 (9:1)에 용해하여 hexane으로 3회 (각각 500, 250, 250 ml 씩) 추출하였다. 남은 aqueous methanol 용액에 물 50 ml을 가하고 carbon tetrachloride (CCl4)로 3회 (각각 500, 250, 250 ml 씩) 추출한 다음 aqueous methanol에 73 ml의 물을 가하여 chloroform으로 3회 (각각 500, 250, 250 ml 씩) 추출하여 CHCl3 추출물 6.06 g을 얻었다. 이 중 5.8 g을 chloroform-methanol (98:2)를 용매로하여 Sephadex LH-20 column (2 in. x 38 in. ) chromatography 를 행하여 활성분획 1.3 g을 얻었다. 이 중 1 g을 silica gel column 에 loading하고 chloroform, ethylacetate, mrthanol순으로 용출시킨 다음 ethylacetate 용출물을 TLC mesh silica gel (25 g)로 재 column chromatography를 실시했다. 용매는 chloroform-methanol (98 : 2)를 사용했으며 활성분획을 모아 chloroform-benzene (1 : 4) 혼합용매로 재결정을 하여 25 mg의 okadaic acid를 얻었다.
4.5 Altemicidin의 분리정제 과정
이물질은 쇠비름, 명아주에 강한 살초활성 갖는 물질로서 방선균 배양액으로부터 분리정제되었다. altemicidin은 수용성의 양쪽성 물질로서 ninhydrin 시약과 bromocresol green에 양성, FeCl3 용액과 Dragendorff's reagent에는 음성으로 나타났으며 EtOH, BuOH, EtOAc에는 불용, H2O에는 용해되는 성질을 보인다.
방선균 배양액의 상등액을 5 N HCl로 pH 4로 조절하여 단백질을 침전시킨 뒤 재차 6,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 단백질 침전층을 제거하였다. 이 상등액은 활성탄을 통과시켜 흡착된 부분을 50 % methanol, 50 % acetone, 80 % acetone 순서로 용출시키고 각 활성분획을 감압농축한 후 anion exchange (음이온 교환) chromatography 를 실시하였다. 약산성 음이온 교환수지인 Amberlite IRA-68 column에 시료를 통과시키고 gradient chamber를 이용하여 15 mM citrate phosphate buffer를 pH 5∼3으로 하여 용출, 활성분획을 모았다. 염(salt)를 제거한 후 감압농축한 후 시료를 다시 강산성 양이온 교환수지인 Dowex 50 column을 통과시켜 0.5 NH4OH 용액으로 용출시켰다. 용출액의 pH를 4로 조절한 후 활성탄을 통과시킨 후 50 % acetone으로 용출시킨 분획을 MCI-gel column에 이행하고 증류수로 용출되는 활성부분을 모아 TLC로서 순수 정제하여 20 mg의 altemicidin을 얻었다. 이때 cellulose F plate 를 사용했으며 전개용매로는 butanol-methanol-H2O (3 : 1 : 2)를 사용했다.
참고문헌
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