exp 4[1]. 척수 뇌 근육조직의 고정

본문내용

시킨 후 염색을 한다. 염색 방법으로는 Hematoxylin/eosin을 사용한다. 이 염색법은 염기성과 산성 색소로 염색해 이를 2중 염색법이라 한다. Hematoxylin은 탈파라핀과 함수과정 후에 사용된다. 이 염료는 세포의 핵, 특히 핵 내의 염색질과 핵막에 염색된다. 핵의 핵질(nucleoplasm)은 염색되지 않은 채로 남기 때문에 염색질의 염색패턴을 쉽게 볼 수 있다. Hematoxylin은 산화시켜서 hematein으로 만든 후 hematein이 붙도록 매염제를 사용해 hematein을 조직에 붙이는데 이는 hematoxylin은 색깔을 내지 않고 조직에 붙지도 않으며 hamatein은 색깔을 내긴하나 잘 붙지 않기 때문이다. 매염제는 한쪽은 hamaton을 잡고 한쪽은 조직 내 산성을 띄는 원자단을 잡는 역할을 하여 거의 백반을 많이 이용한다. 결국 백반을 이용해 hamatein백반-산성 원자단 복합체를 만드며 이 복합체는 푸른색을 띤다. Hematein은 산성을 띠는 원자단과 결합하므로(백반이용) 염기성 염료로 분류한다. Hematoxylin이 염색이 잘 되지 않았으면 ①자가융해와 고정불량 ②불충분한 탈파라핀 ③과탈회 ④부적당한 염색시간 ⑤과도한 분별 ⑥약한 Hematoxylin의 사용(오래 되거나 물 이동이 잦은 경우) ⑦헹굼용액(rinsing solution)의 희석 ⑧너무 얇은 절편의 사용 ⑨Hematoxylin용액의 부적당한 pH ⑩Alcohol의 제거가 불충분하거나 Hematoxylin 염색 전에 충분히 물에 수세하지 못했을 경우라고 생각할 수 있다.
반면 염색이 너무 강하게 되었으면 ①조직절편의 건조 ②조제시 Hematoxylin 양이 많이 첨가되었을 경우 ③과도한 염색시간 ④과도한 접착제 사용(예 : 알부민, 젤라틴) ⑤불충분한 분별 ⑥너무 두꺼운 절편의 사용 ⑦열에 너무 오래 노출되었을 경우이다.
Eosin은 HE염색에서 에오신은 대조염색(counterstain)으로 사용된다. 이 염료는 헤마톡실린에 염색되지 않는 거의 모든 구조에 염색된다. 에오신은 정확하게 사용하면 3가지의 다른 색상을 얻을 수 있어 여러 조직성분을 감별하는데 사용할 수 있다. 즉, 적혈구는 dark reddish orange, 교원섬유는 lighter pastel pink 그리고 평활근은 bright pink로 염색된다. Eosin은 산성 염료이기 때문에 염기성을 띠는 원자와 결합하여 색깔을 낸다. Eosin의 염색이 약한 원인은 ①eosin의 pH가 너무 높을 경우 ②eosin 염색 후 alcohol에 너무 오래 헹구거나 alcohol 농도가 낮을 경우 ③eosin 염색 후 사용하는 alcohol 헹굼액이 오염되었을 경우 ④과다한 사용으로 인해 eosin의 작용이 저하되었을 경우 ⑤너무 얇은 조직절편을 사용하였을 경우 ⑥염색시간이 너무 짧을 경우이다.
반면 너무 강한 원인은 ①용매의 증발로 인해 염료농도가 높아질 경우 ②염색 후 ethanol 대신 isopropanol로 헹구었을 경우 ③너무 두꺼운 조직절편을 사용하였을 경우 ④염색시간이 지나치게 길었을 경우 ⑤eosin의 pH가 너무 낮을 경우이다.
Eosin으로 염색을 하면 3가지의 다른 색상을 얻을 수 있는데 한 가지 색으로만 나타나는 원인은 ①고정불량 ②과염색 ③수용성 eosin 사용 ④염색시간이 지나치게 길었을 경우 ⑤너무 강하게 염색하였을 경우이다.
이러한 eosin을 정확하게 염색상을 얻기 위해서는 일반적으로 3가지 요소, 즉 염색시간, 염색 후 사용하는 alcohol의 농도, 이들 alcohol에서의 헹굼 시간을 고려하여야 한다. Eosin은 물에 매우 잘 녹기 때문에 eosin 염색 후에 사용하는 alcohol 내에 물이 많이 포함되어 있을수록 조직으로부터 eosin이 더욱더 많이 제거된다. 만일 eosin 염색 후 사용하는 alcohol로 ethanol을 사용할 수 없다거나 경제적인 이유로 isopropanol을 사용해야 한다면 그 한계성을 고려하여 염색과정을 수행하여야 한다. 무수 isopropanol에서는 eosin이 잘 녹지 않기 때문에 과도하게 염색된 eosin은 씻겨지지 않는다. eosin 염색이 과도하게 되었을 경우에는 희석된 isopropanol(70%, 95%)를 사용하여 제거한다.
이렇게 hematoxylin과 eosin을 처리한 후 slide에 다시 xylene을 첨가하면 alcohol 제거와 동시에 mounting시 접착제가 잘 녹아들 수 있게 도와준다.
Mounting은 PBS로 3회 세척하고 90% glycerol 이용하여 mounting. Slide glass에 mounting solution을 10 ml 정도 점적한 후 염색한 coverslip을 tweezer로 조심스럽게 들어 올려 휴지에 세워 남아 있는 물기를 제거 하고 난 후 slide glass에 뒤집어서 (세포가 부착되어 있는 면이 밑으로 가도록) 한쪽 끝에서부터 덮는다. 기포가 들어가지 않도록 주의한다. Coverslip 밖으로 넘쳐 나온 mounting soluton을 휴지로 흡수 시키고 coverslip이 움직이지 않도록 투명 메니큐어로 디스크 끝부분을 고정시켜 준 후 5 min 정도 말리고 난 후에 형광현미경으로 관찰한다. 관찰 결과 프레파라트를 5개 정도 만들었는데 2개정도만이 잘 되었고 나머지 3개는 염색이 잘못 되었거나 section을 잘못하여 조직이 깨지게 보인다.
일반적으로 실험실에서 무엇을 관찰하고자할 때 임시프레파라트를 만들며 영구적으로 보존할 때나 일시적 관찰로는 어려울 때 우리는 이번 실험에서와 같이 영구 프레파라트를 제작한다. 이번실험에서 영구 프레파라트를 처음 만들었는데 생각보다 어려운 과정이 많았다.
5. References
: 인체생리학, 김종대, 정문각, 1997년, 245p ~ 250p
: 인체조직학 2판, 김원식외 공저, 정문각, 2003년, 15p ~ 18p
: 해부생리학, 정해만, 정문각, 1998년, 360p ~ 362p
: 조직학, L.C jungueira, 고려의학. 1999년, 1p ~ 4p
: 생리학, 김정진, 고문사, 1977년, 240p ~ 244p

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