[생물]닭 근위(모래주머니)에서 키틴분해효소의 분리 및 정제 보고서

본문내용

과물을 그 다음에 오는 chromatography를 가지고 계속적인 분리를 하여 그 순도를 높이는 것이었으나 실험 여건상 연결된 실험보다는 각각의 실험을 해보는 것에 의의를 두었다. 1주차 실험인 Anion exchange chromatography의 결과는 bound와 unbound의 결과가 뚜렷이 나타났다. washing에 의해 나온 unbound쪽의 protein은 -charge, gradient로 인해 증가된 NaCl로 떨어져 나온 unbound쪽의 protein은 +charge를 띈다. 2주차 실험 cation exchange chromatography의 결과 또한 bound 부위와 unbound 부위가 확실히 나왔는데 각 부위가 가르키는 protein의 charge는 Anion exchange chromatography와 반대이다. HIC의 결과는 언덕이 3개가 나왔는데 2번째 언덕은 염, 즉 (NH4)2SO4 in Tris-HCl의 농도가 줄여들기 시작할 때 생겼다. 즉 이는 실험적 오차가 아니라 염농도의 감소로 인해 첫 번째보다 소수성을 많이 띄나 마지막 언덕의 protein보다 소수성을 적게 띄는 protein이 소수성 bead에서 떨어져 나온것임을 알수있다. 염농도가 0에 가까워갈 때 하나의 언덕이 더 생기는데 이 언덕에 해당하는 protein이 가장 소수성부위가 많은 protein이다. 5주차 실험에서는 Lowry-Folin 법을 이용하여 단백질의 농도를 구했는데 standard curve의 식이 y=0.2613x-0.0228로 구하고자 하는 시료가 570nm에서 0.049의 ABS를 나타내므로 시료의 농도 0.275mg/ml를 구할수 있다(1/10희석한 시료이므로 2.75mg/ml). 마지막 실험인 SDS-PAGE 전기영동의 경우는 판독이 거의 어려워서 결과를 판단하기 힘들다. loading량은 적당했으나 그 loading시 들어있는 protein의 양이 적었던 것 같다. 가령 판독이 가능했다면 marker로 그래프의 추세선을 만든뒤 이동거리를 파악하여 chitinase의 분자량을 파악할수 있었을 것이다.(혹은 chitinase의 경우 분자량이 약 47,000정도로 알려져있기 때문에 이미 알려진 marker 밴드위치와 비교하여 chitinase를 포함한 sample을 파악할수 있었을 것이다.)하지만 판독불가로 chitinase의 특성을 알기 어렵고 가령 판독이 되더라도 각 chromatography를 차례로 시행하며 분리한 것이 아니라 하나의 샘플로 각각의 chromatography를 시행해 얻은 결과이므로 하나의 밴드가 아닌 여러개의 밴드가 생기므로 어느것이 원하는 효소의 밴드인지 알수가 없었을 것이다. 즉 밴드에서 분자량을 구하기는 어려웠을 것이다. 혹은 반대로 chitinase가 47,000의 분자량을 갖는다는 사실을 알고 47,000대의 분자량을 갖는 밴드의 샘플을 chitinase를 갖는 샘플이라고 판단할 수는 있을것이다.(하지만 여기에도 문제는 있다. 비슷한 분자량의 효소와는 구분하기가 어렵다는 것이다.)여기서는 대략적으로 chitinase의 charge나 pI 등을 판단할수 있었을 것이다.
Marker band
MW
116,000
94,000
47,000
37,000
27,500
19,300
Fig 11. Marker band의 이동거리와 분자량 간의 그래프를 그린 뒤 샘플 band의 이동거리에서 분자량을 구할수 있다.
▲ Refernce
http://www.ajou.ac.kr/~biochem/lecture/protein.ppt
http://www.shingu.ac.kr/%7Edolchoi/lc_bc/bc3-3.html
http://search.empas.com/search/ok_pvw.html?pt=0&ft=2&i=5022731&q=folin&q2=folin&dv=a
&sn=1205443072&w=2b6c6d&dw=6d&vl=A&vn=1&ou=kin.naver.com%2Fbrowse%2Fdb_detail
.php%3Fd1id%3D11%26dir_id%3D11%26docid%3D683169&dd=1
http://kin.naver.com/browse/db_detail.php?d1id=11&dir_id=110204&eid=eSy2kxiXNm5HRxoljCbVtPBcNL5vKNan
http://kr.ks.yahoo.com/service/wiki/wiki_view.html?word=%C0%FC%B1%E2%C0%CC%B5%BF

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생물,   생명공학,   생공,   키틴,   분해효소,   분리,   정제,   결과