[생화학 실험보고서] E. coli system을 이용하여 Taq polymerase를 Overexpression시킨 후 정제

본문내용

있을 가능성과 resin에 binding하지 못하고 그냥 쓸려 내려온 Taq polymerase 두 가지 경우로 예측되며, 그 양이 생각보다 많았다(약 1 ㎍). 지난 주 실험에서도 F.T.의 양이 생각보다 많았었는데, 이는 purification이 덜 진행되었기 때문에 발생하는 undesired protein(size는 비슷한)일 가능성이 보다 클 것 같다. Intrinsic하게 (+) charge를 갖는 Taq polymerase가 (-) charge를 띄는 resin에 binding하지 못하는 이유를 설명하기 힘들기 때문이다. Washing에서는 sample이 전혀 검출되지 않았는데 이는 resin에 binding된 protein이 거의 다 Taq polymerase일 것이라는 사실을 반증한다.
v) Elution sample을 loading할 때, E3과 E4의 위치가 바뀌어 loading되었다. 원하는 결과대로라면 E1, E4에서 얻어지는 Taq polymerase의 양이 E2, E3에서보다 적어야 할 것인데, E3과 E4의 양을 비교하여 보면 E4의 양이 더 많았다. 그 이유는 E2와 E4 사이의 SDS-PAGE well이 무너져 내려 E2의 sample이 E4에 섞였기 때문이다. 따라서 실험이 정상적으로 수행되었다면 E2의 양이 좀 더 많이 나왔을 것이고, E4의 양은 E3의 양과 같거나 적게 나타났을 것이다.
2) 모든 step이 purification을 상당히 높은 수준으로 증가시켰다고 생각한다. 다만 상대적으로 Yield를 많이 감소시키는 step은 PEI를 사용한 step과 resin에 sample을 거는 step이라고 할 수 있다. 이는 Column input sample의 yield와 Flow-through의 yield를 확인하여 알 수 있다. 원하는 target protein을 분리 정제할 때에는 purification fold와 수득률(yield)이 모두 중요하다. 하지만 상업적으로 쓰이는 목적이 아닌 이상 이후에 보다 정확한 실험을 설계하기 위해서는 원하는 protein의 purity가 높을수록 좋을 것이다. 때문에 PEI를 이용한 charge-dependent purification은 없어도 되는 step이 될 수는 없다(purification의 증가폭이 매우 높았기 때문이다. 모든 step이 purification을 높은 수준으로 증가시켰기 때문에, 가장 yield를 낮춘 step만을 적었다.). Flow-through에서 떨어지는 desired protein을 낮은 양으로 바꾸기 위해서는 resin의 equilibration이나 packing, PEI purification step에 보다 유의하여 실험해야 할 것이다.
7. 참고문헌
1) 생화학실험(2) 실험교본, 교육과학기술부의생명특성화사업단.
2) Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer. 2007, Biochemistry, sixth ed.
3) http://en.wikipedia.org/wiki/

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