단백질 정량실험 spectrophotometer의 원리와 그를 이용한 시료농도 측정 실험

소개글

단백질 정량실험 spectrophotometer의 원리와 그를 이용한 시료농도 측정 실험에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. 단백질
(1) 뷰렛 시험
(2) 분광학적 정량법
(3) Lowry 시험(Folin-Ciocalteau )

2. spectrophotometer의 원리와 그를 이용한 시료농도 측정
I. 원리
A. 흡광도
1. 흡광도란?
2. 흡광도의 범위
3. 흡광도의 신뢰구간
B.SDS-PAGE
1. SDS PAGE의 정의
2. SDS PAGE의 원리

본문내용

하며 신뢰구간은 시료의 종류와 분석을 실시하는 파장( )에 따라 약간의 차이가 있지만 대부분의 경우 0.2∼0.8을 신뢰구간으로 생각한다.
실험시 시료의 농도가 이 신뢰구간을 벗어나는 경우 희석이나 농축의 과정을 통해 실험값이 신뢰구간 내에서 관찰되도록 해야 한다.
b.구조
lamp에서 안정된 형태로 빛(근적외선, 가시광선, 근자외선) 방출
4. prism을 통과하여 각 영역대의 빛이 분리됨
5. 사용자가 특정파장의 빛을 선정하면 slit이 해당 파장의 빛이 지나는 위치로 이동, 해당 파장의 빛만 통과됨
6. cuvette을 통과하며 빛이 시료에 흡수됨
7. cuvette을 통과한 빛은 광전판에 조사되며 광전판은 조사된 빛의 세기에 따라 다른 전류를 흐르게 함
8. 전류계에서 전류의 양을 측정하여 흡광도를 계산, 계산된 흡광도 값을 display한다.
3.SDS-PAGE
1. SDS PAGE의 정의
SDS PAGE란 단백질을 그 크기에 따라 분리하는 방법이다.
(sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis)
2. SDS PAGE의 원리
샘플을 로딩하고 전기를 걸어주면 이온들은 (+)쪽으로 진행하게 된다.
이 때 이동되는 것이 단백질, Cl 이온, Glycine 이온 등이 있다.
이 경우 단백질은 SDS에 둘러싸여 있어서 모드 음전하를 띠고 있고 Cl- 역시 음전하를 띤다. 문제는 글리신인데 이것의 pI (Net Charge 가 0이 되는 pH)가 대략 6.2 정도이다. 따라서 글리신은 pH6.8의 Stacking gel에서 일부만 음전하를 띠게 되는 것이며 결국 Stacking gel에서의 이온들의 이동속도는 Cl- > 단백질 > Glycine 이온의 순서가 된다.
전기장을 걸어주었을 때 염소이온은 가장 작기 때문에 가장 먼저 이동하고 글리신은 늦게 이동하게 된다. 이렇게 이온들간의 이동의 차이가 생기면 그 사이에는 국부적으로 High Voltage gradient가 만들어지게 되며 결국 그 안의 단백질의 움직임은 매우 빠르게 움직이게 되는 것을 의미한다.
이렇게 단백질의 이동속도가 두 이온(염소이온, 글리신잉온)사이에서 빨라진다는 것은 단백질 크기가 크거나 작은 것의 차이로 인한 이동속도 차이를 거의 없게 만드는 의미가 있다. 물론 여기서 폴리아크릴아마이드의 조성도 상대적으로 작아 큰 단백질도 쉽게 내려갈 수 있는 이유도 있겠지만 보다 본질적으로 큰 단백질의 이동속도가 염소/글리신이온으로 형성되는 영역에서 빠른 속도를 받게 되어 작은 크기의 단백질과 비슷해지는 것이 중요한 포인트이다.
작은 단백질이 더 빨라지는 것도 생각해 볼 수 있지만 이것은 어디까지나 염소/글리신이온의 영역 내에서만 해당되는 것이고 염소이온 이동선을 넘어갈 때는 그러한 속도증가효과가 없어진다.
결국 stacking gel에서는 염소/글리신 이온 간의 gap에 크기에 관계없이 단백질들이 모여서 이동하게 되고 (Stacking이라 불리는 이유) 이것은 이후 Running gel에서 Starting line을 동일하게 만들어 줌으로 분자크기간의 비교를 좀 더 정확하게 볼 수 있게 되는 것이다.
Running gel의 경우 pH는 8.8 정도로 이제 Glycine은 완전히 이온화가 되어 모든 단백질보다 빠르게 움직일 수 있게 된다. 즉 Running gel에서의 이온들의 이동속도는 Cl- > Glycine > 단백질 이온의 순서가 됩니다. 이렇게 되면 염소/글리신이온사이의 영역도 거의 없을 뿐 아니라 있다 하더라도 단백질은 이에 무관하게 움직인다. 이 때부터 단백질들의 움직임은 단백질 크기에 따른 움직임으로 변하게 되는 것이다.

키워드

단백질,   정량,   흡광,   spectrophotometer,   고려대,   생명유전,   흡광분석,   생화학