유전(자) 실험 관련

목차

제 1 장 서론
제 1 절 실험목적

제 2 장 실험방법
제 1 절 Culture condition
제 2 절 Agarose gel electrophoresis
제 3 절 Southern blotting
제 4 절 Southern hybridization
제 5 절 SDS-PAGE
제 6 절 Western blotting

제 3 장 Materials and Methods
제 1 절 Culture condition
제 2 절 Agarose gel electrophoresis
제 3 절 Southern blotting
제 4 절 Southern hybridization
제 5 절 SDS-PAGE
제 6 절 Western blotting

제 4 장 Results and Discussion
제 1 절 gfp유전자의 확인
제 2 절 Southern blotting 결과

본문내용

사이를 뚫고 separating gel로 들어간다. 이에 힘입어 경계면에 납작하게 축적되었던 SDS polypeptide complex도 separating gel로 들어가며, 각 polypeptiderks의 전기영동은 새로이 시작된다. Separating gel에서는 그 작은 pore size로 인하여 각 SDS polypeptide complex들은 sieving되어 각 분자량에 의하여 이동속도의 차이를 보이게 된다.
제 6 절 Western blotting
Western blotting(Immunoblottting)은 specific antiody를 이용하여 단백질 혼합물 중에서 원하는 단백질(antigen)만을 찾아내는 방법이다. 실험 방법으로 DNA에서 Southern blotting, RNA에서 Northern blotting과 같이 protein을 전기영동으로 분리시켜 놓고 이를 Nitrocellulose filter에 transfer시키고, 목적하는 단백질 band를 immunological 방법으로 detection하는 기법이다.
Western이라는 말은 E. M. Southern이 DNA의 Capillary Method를 발표한 이래 Southern blotting이란 이름으로 불리우자, 창안자 이름의 원뜻에 대비하여, RNA에서 Northern이, 단백질에서는 Western blotting이란 이름으로 불리게 된 것이며, H. Towbin등이 처음 창안하였다. 여기서 사용되는 protein 전기영동 방법은 단백질들을 denaturation시켜 단백질의 분자량에 의하여 이동 속도를 달리하여 분리시키는 SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)이며, 이는 또한 발견자의 이름을 따서 Laemmli's gel이라고도 한다.
SDS-PAGE는 단백질 고유의 aggregation을 방지하고, 각 polypeptide로의 분리를 위하여 sample의 제조부터 reducing agent인 β-mercaptoethanol과 anionic detergent인 SDS를 사용한다. 이로써 단백질은 denaturation되며, 거의 polypeptide의 크기에 따라 SDS가 붙게 되어(약 1.4g SDS/1g protein), negative charge를 띠게 된다. 따라서 SDS polypeptide complex는 전기영동 중 polypeptide의 분자량과 비례하는 이동 속도를 가지게 된다.
Laemmli's gel의 또 하나의 특징은 일반적인 전기영동 방법인 continuous buffer system이 아닌 discontinuous buffer system을 사용한다는 것이다. 이는 단백질 gel에서보다 해상력을 높게 만든 것으로 본 실험의 stacking gel의 기능에서 자세히 설명되었다.
Laemmli's gel의 Western blotting(transfer)에는 Graphite blotter가 사용된다. 이는 semi-dry법이라고도 하며, 흑연 판으로 만든 넓은 음/양극판 사이에 gel과 buffer에 적신 Whatman paper를 넣고 electro-transfer 하는 것이다. 이는 기존에 사용되던 Tris-Glycine buffer tank내에서 진행하던 electro-transfer방법에 비하여 시간 절약 및 간편함이 있다.
사용되는 filter는 nitrocellulose, nylon membrane, PVDF(polyvinylididne difluoride)등이 사용되며, Transfer되었는지 여부는 물로 세척이 가능한 Ponceau S stanining이 사용된다.
Transfer의 결과로써, membrane상에 위치된 단백질의 결합부위는 BSA, hemoglobin, gelatin, non-fat milk와 같은 non specific protein과 tween 20과 같은 detergent로 구성된 blocking agent를 사용하여 non-specific binding을 막는다.
western실험에서 가장 중요한 과정은 단백질 혼합 band중에서 원하는 단백질만을 detection하는 항원-항체 반응이며, 따라서 western blotting의 probe로 사용되는 항체는 매우 특이성이 높아야 한다. 항체 반응후의 발색 방법으로 fluorescein isothoicyanate와 같은 형광물질의 사용, 125P등의 방사능 동위원소를 사용, peroxidse, alkaline phosphatase, β-galactosidase, glucoseoxidase 등 enzyme reaction을 이용하는 방법등이 이용되고 있다.
일반적으로 효소반응을 이용하는 방법이 가장 널리 사용되고 있으며 이때 antigen- antibody complex는 secondary antibody에 연결되어 있는 HRPO (horseradish peroxidase) or alkaline phosphatase와 같은 효소와 결합되며, 발색을 위하여 효소의 기질로써 DAB(3,3'-diaminobenidine 같은 chromogenic substrate 또는 lumigen같은 luminescent substrate를 사용한다.
western실험에 사용되는 단일클론항체의 antigenic epitope는 detection하고자 하는 단백질의 specific amino acid residue이며, 이는 불과 10개 정도의 amino acid residue에 불과하다. 또한 transfer된 단백질은 denaturtion된 상태이며, 이는 native protein과 그 구조상에서 별개일 수 있다. 따라서 detection에 사용되는 항체가 native antigenic protein에서 만들어졌다면, native protein을 사용한 ELISA 실험에서 양성반응이 보이더라도, western blotting에서는 native protein에서만 민감한 monoclonal antibody가 작용하지 못할 수도 있다.
제 3 장 결과 및 고찰
제 1 절 gfp유전자의 확인
제 2 절 Southern blotting 결과

키워드

Plasmid DNA,   Agarose gel electrophoresis,   Southern blotting,   Southern hybridization 예정,   SDS-PAGE,   Western blotting