[기기분석] GPC(겔크로마토그래피)를 이용한 분자량에 따른 분리

소개글

[기기분석] GPC(겔크로마토그래피)를 이용한 분자량에 따른 분리에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. Theme
2. Date
3. Purpose
4. Principle
5. Reagent & Equipment
6. Method
7. Result
8. Disccusion

본문내용

lumn의 조제, 용출 시에 column이 굳어지지 않도록 주의
7. Result
흡광도 : 헤모글로빈 측정
⇒ 60분에 peak가 나타남
총당분석 : 덱스트란 측정
⇒ 160분째부터 값이 커지면서 165분에서 175분까지 peak가 나타남
8. Disccusion
이번 실험에서는 GPC를 이용하여 분자량이 다른 2종의 물질을 겔여과법으로 분리해보았다. GPC는 분자체 효과를 이용하는 크로마토그래피인 크기배제 크로마토그래피의 한 종류로, 긴 컬럼 안에 고정상의 역할을 하는 gel로 충진 시키고 용매를 넣은 뒤 이 컬럼 안으로 고분자용액을 투과시켜 컬럼 안에서 고분자가 크기에 따라 분리되도록 하는 방법이다.
가장 먼저 고정상인 겔을 전처리해주었는데 우리가 사용한 겔은 sephadex G-50으로, 단백질 분리에 주로 사용되는 겔여과용 담체의 일종이다. 겔의 큰 고분자 사슬에 있는 수산기 때문에 매우 극성이며 많은 물을 흡수한다. 세파덱스의 번호는 가교도의 차이에 따른 것으로 물의 재흡수값에 관계되어있다. 예를 들어 우리가 사용한 sephadex G-50은 마른 겔 1g당 약 5ml의 물을 흡수할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 겔의 유형에 따라 팽윤도와 흡수능을 고려하여 NaCl의 양을 대략적으로 계산해주어야 한다. 우리는 겔 10g을 1%의 NaCl 65~75ml에 12시간 정도 가열하여 팽윤시켜주었다. 이 때 증류수가 아닌 NaCl같은 묽은 염용액을 이용하는 이유는 겔의 균일성과 팽윤속도를 높이기 위해서이다. 팽윤을 하고나서 겔 성분 이외의 불순물이나 손상된 겔을 제거하기 위해 세정해 주었다. 0.5M의 HCl 200ml을 넣어 섞고 층분리가 되면 상등액을 버리는 과정을 2회 반복해 주었고, 산을 중화시키기 위한 0.5M의 NaOH도 같은 방법으로 진행하였다. 마지막으로 증류수로 1회 세척한 뒤, 세정한 겔을 흡인여과기에 여과지를 넣고 여과하여 주었다. 여과한 겔에 2~3배 정도의 NaCl을 넣고 sonicator를 이용하여 1분간 탈기해주었는데, 탈기는 유출패턴을 변화시키는 기포를 제거하고 겔의 흐트러짐을 방지하기 위해 진행하였다.
다음으로 컬럼을 세척하고 수직으로 세운 유리제 컬럼에 1%의 NaCl을 1/3 높이까지 주입하고 수평계를 확인하였다. 균일하게 현탁한 겔을 관벽을 흘러내리도록 천천히 주입하였다. 겔을 평형화하기 위해 컬럼의 밑층에 겔이 1cm정도 가라앉으면 pinch cock을 열어 잔량의 겔을 서서히 주입하고 pump를 작동시켰다. 겔이 완전히 가라앉으면 압력을 걸어 충분한 양의 1% NaCl을 흘려서 유속은 1~2, NaCl은 충진된 겔 양의 5배 정도를 흘려 컬럼을 24시간 동안 평형화 시켜주었다.
분리하기에 앞서 시료를 조제해주었는데, 헤모글로빈 20mg/ml와 덱스트란 100mg/ml을 1ml씩 혼합하였다. 헤모글로빈은 적혈구에 있는 색소 단백질로 체내에서 산소를 운반하는 역할을 하며 분자량이 약 64500에 이르는 고분자이다. 덱스트란은 글루코오스의 글리코시드 결합을 주체로 하는 점질성 다당류로 분자량이 매우 다양한데, 우리가 이용한 덱스트란의 경우에는 약 6000정도로 비교적 작은 분자이다.
겔이 평평하지 않으면 시료 분리 과정에 오차가 있을 수 있으므로 시료를 주입하기에 앞서서 겔의 상단이 완전히 평평한가 확인해주었다. 다음 겔의 상단에 존재하는 용매를 제거해주었는데 이 때 겔이 깨지지 않도록 주의해주어야 한다. 시료 0.5ml을 취하여 컬럼의 상부에 겔이 손상되지 않게 관벽을 흘러내리도록 하여 주입하였다. 시료가 충진된 겔에 충분히 스며들도록 코크를 열고 이동상의 역할을 하는 1%의 NaCl을 컬럼의 상층부까지 주입하여 주었다. 시료의 분리를 위해 펌프의 유속을 1~2정도로 설정해주었는데, 유속이 너무 빠르면 겔에 균열이 생기고 분리능이 떨어지며 너무 느리면 분리시간이 길어지기 때문에 잘 설정해주어야 한다. fraction collector는 칼럼 용출액을 일정량씩 또는 일정시간마다 순차로 자동적으로 측정하는 장치로 우리는 5분에 3ml로 설정하여 총 200분간 분리하였다.
출액을 취하여 흡광도를 측정해주었는데, 헤모글로빈의 경우 적색을 띄고 있기 때문에 별다른 처리 없이 96well plate에 취하여 340nm의 파장으로 측정해주었다.
덱스트란의 경우에는 색을 띄지 않기 때문에 총당분석을 진행해주었다. 총당은 식품 전체에서 조단백, 지방질, 수분, 회분량을 뺀 나머지를 말하며 우리는 페놀-황산법을 이용하였다. 환원당을 진한 황산으로 처리하면 탈수되어 furfural 또는 그 유도체가 되고 그 유도체의 흡광도를 측정하여 분석하게 된다. 시료희석액 0.6ml과 5%의 페놀 0.3ml을 혼합하고 혼합액에 황산 1.5ml 첨가 후 85℃로 예열한 waterbath에서 30분간 반응시켜 주었다. 방냉한 후에 96well plate에 200㎕씩 분주하고 490nm에서 흡광도를 측정해주었다. 측정한 결과를 바탕으로 그래프를 그려주었다. 헤모글로빈의 분리를 알아보기 위해 흡광도를 측정한 결과 60분에 peak가 나타났고, 덱스트란의 분리를 위해 총당분석을 진행한 결과 160분째부터 값이 커지면서 165분에서 175분까지 peak가 나타났다.
이로써 헤모글로빈이 더 빨리 용출되고 덱스트란이 비교적 늦게 용출되는 것을 볼 수 있었다. 분자량이 큰 물질의 경우 분리를 진행하면 충진물질의 공극을 통과하지 않고 입자사이로 빠져나오게 되므로 컬럼을 통과하는 시간이 빨라 먼저 용출되며 분자량이 작은 물질의 경우 입자의 공극을 돌아다니다가 빠져나오게 되므로 컬럼을 통과하는 시간이 오래걸려 늦게 용출된다. 따라서 헤모글로빈의 분자량이 더 크다는 것을 알 수 있었고, 이는 우리가 기존에 알고있던 내용과도 같았다.
또한 덱스트란의 흡광도 그래프를 보면 헤모글로빈이 용출된 시간과 같은 60분에 약간 값이 올라간 것을 볼 수 있는데, 이는 헤모글로빈이 영향을 주었기 때문일 것으로 생각된다.
따라서 우리는 이번 실험을 통해 고정상인 겔의 특성에 대해 알게 되었고, 시료의 특성에 맞게 흡광도를 측정하여 분자량의 크기에 따라 분리 속도가 다름을 알 수 있었다.

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